Un equipo de investigadores de la Universidad Farmacéutica de China, liderado por Mengwei Li y Xiao-Nan Zhang, diseñó una nueva sonda química denominada PCCT-NAD+. Esta herramienta permite mapear con mayor precisión las redes de proteínas que responden al estrés celular, expandiendo el conocimiento actual sobre procesos biológicos que van mucho más allá de la reparación del ADN.
El estudio, publicado en la revista Targetome, aborda las limitaciones de las técnicas anteriores relacionadas con la poli(ADP-ribosilación) o PARilación. La PARilación es una modificación postraduccional reversible en la que las enzimas PARP utilizan NAD+ para ensamblar cadenas de polímero (PAR) en las proteínas, funcionando como andamios de señalización para reclutar moléculas en diversos procesos celulares.
Un avance en la precisión de la captura
Las sondas proteómicas desarrolladas con anterioridad introducían grupos químicos en posiciones aleatorias a lo largo de las cadenas de PAR. Esa modificación solía alterar la estructura nativa del polímero, obstruir las superficies de unión y dificultar la captura de interacciones débiles o transitorias.
Para solucionar este inconveniente, la nueva sonda PCCT-NAD+ actúa tanto como agente fotorreactivo como terminador de cadena durante la síntesis de PAR catalizada por la enzima PARP5A. De este modo, ubica el grupo funcional en el extremo terminal del polímero. Las cadenas obtenidas, en su mayoría de al menos 20 unidades de longitud, fueron biotiniladas mediante química click y fijadas sobre esferas magnéticas.
Al exponer las muestras a luz ultravioleta de 365 nanómetros, el sistema estabilizó covalentemente los enlaces entre el PAR y las proteínas asociadas. En las pruebas de validación, la sonda unió el macrodominio AF1521 y el dominio WWE con una fuerza aproximadamente 2,8 y 2,1 veces mayor, respectivamente, en comparación con las sondas de incorporación aleatoria previas.
Respuesta celular frente al estrés oxidativo
Para aplicar el método en un entorno biológico, los científicos trataron células HeLa con 500 micrómetros de peróxido de hidrógeno durante dos horas con el fin de provocar estrés oxidativo. El posterior análisis por espectrometría de masas identificó 1.576 proteínas enriquecidas de forma diferencial.
La clasificación funcional de estas proteínas reveló una profunda reorganización de los sistemas de traducción y control de calidad celular:
- 266 proteínas vinculadas a modificaciones postraduccionales, recambio proteico y chaperonas.
- 132 proteínas involucradas en la traducción y la biogénesis de ribosomas.
- 33 proteínas asociadas a la replicación, recombinación y reparación del ADN.
Asimismo, los análisis de vías metabólicas (KEGG) señalaron 72 proteínas asociadas en la ruta del ribosoma, mientras que las evaluaciones de Ontología Génica destacaron la traducción citoplasmática y la unión al ARN.
Entre los hallazgos del trabajo, los investigadores validaron experimentalmente cuatro proteínas representativas: RPLP1, FCF1, PRIM2 y EIF2S1. En el caso de RPLP1, se observó una marcada reducción: su nivel proteico total cayó al 54 % respecto al control, su señal de captura por PAR descendió al 4 % y la abundancia de su ARN mensajero disminuyó al 55 %, confirmando el impacto del estrés sobre la maquinaria de síntesis proteica.